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Équipe 2 « RMN des Assemblages Moléculaires »

par Webmaster - 1er mars 2009

Responsable : Françoise Guerlesquin

Composition de l’équipe

Permanents :

  • F. Guerlesquin (DR1, CNRS)
  • C. Kreuzer (MCF, Université de Provence)
  • L. ElAntak (CR2 – CNRS)
  • M. Noualllier (MCF – Université de Provence)
  • H. Halimi (IR2 – CNRS)
  • **Olivier Bornet IR2, CNRS (RMN plateforme IFR88)

Non-permanents :

  • M. Feracci (Doctorant 3ème année, BBSG, Université de Provence, Financement INCa) – Directeur de Thèse Françoise Guerlesquin
  • E. Garcin (Doctorant 1ère année, BBSG, Université de Provence) – Directeur de Thèse Françoise Guerlesquin

Synopsis

Notre groupe s’intéresse aux différentes approches qu’offre la RMN pour l’étude des protéines et de leurs complexes dans un contexte biologique. L’axe principal de nos activités est l’étude des interactions entre macromolécules : protéines/protéines ou protéines/acides nucléiques. La RMN est une méthode de choix pour résoudre la structure de complexes dans des conditions proches du milieu réactionnel naturel (pH, T°, force ionique…). Nous nous intéressons plus particulièrement à l’assemblage de ces complexes dans ces conditions extrêmes. Les interactions protéines/protéines peuvent faire intervenir d’autres intermédiaires (groupements phosphates de résidus phosphorylés ou sucres pour des protéines glycosylées). Nous développons des approches spécifiques à ces systèmes comme l’observation du 31P.

Enfin, nous nous intéressons au développement d’autres approches nécessaires aux biologistes telles que la RMN in vivo, le criblage de petites molécules (substrat ou inhibiteur), la RMN du solide…

L’activité du groupe s’intègre dans les travaux de la plateforme de RMN de l’IFR88. Cette plateforme a été labélisée, comme notre équipe, par le cancéropole PACA et est ouverte à des collaborations avec des académiques et des industriels.

La RMN est l’une des deux méthodes les mieux adaptées pour l’étude de la structure des protéines et elle est particulièrement appropriée à l’étude des interactions entre macromolécules. Notre activité de recherche, ces quatre dernières années s’est organisée autour de trois axes : l’étude de la structure de protéines et de leurs interactions, la conception d’inhibiteurs de ces interactions et l’analyse fonctionnelle des protéines. Nos travaux s’articulent dans le cadre de collaborations au sein de l’Unité, de l’IFR88 ou du cancéropôle PACA. Les thématiques développées par notre groupe, nous ont permis de bénéficier en 2007 d’un financement de 850 000 euros (CNRS, Région PACA, Conseil Général des Bouches du Rhône, Mairie et Ministère) pour l’achat d’un spectromètre 600MHz équipé d’une cryosonde et d’un spectromètre RMN 500 MHz équipé d’une sonde 4 noyaux. Notre équipe s’est beaucoup diversifiée ces dernières années avec le développement du drug design par X. Morelli et de la dynamique moléculaire par P. Roche. Leurs activités de ces quatre dernières années seront décrites dans leur rapport d’activité d’équipe. Enfin, l’arrivée de C. Kreuzer, MCF et L. ElAntak, CR2 CNRS, recentre nos activités sur l’étude par RMN des assemblages moléculaires, basée sur les équipements RMN nouvellement acquis.

I Structure des protéines et adaptation aux environnements extrêmes

La cristallographie est la méthode principale de détermination de structure des macromolécules. Cependant, la RMN structurale est particulièrement adaptée à une étude de petites protéines de PM<30kDa, ou de domaines structuraux pour caractériser des mutants ponctuels, analyser la dynamique moléculaire ou mettre en évidence des zones d’interaction avec des ligands. Notre groupe possède donc une activité « calcul de structures » grâce au spectromètre 600MHz équipé d’une cryosonde, et à l’accès au 800MHz de l’IBS de Grenoble. L’arrivée de Corinne Kreuzer et de Cyril Pimentel au laboratoire a permis de relancer cette activité en implémentant CARA (un logiciel d’aide à l’attribution automatique) et CYANA (un logiciel de calcul de structure automatique). Dans le cadre du projet de l’unité, une étude structurale sur les thiorédoxines de Desulfovibrio a été entreprise avec deux objectifs : la mise en évidence des paramètres de stabilisation des protéines à de basses températures (M2 V. Sénille et R. Bourgeas ; collaboration P. Roche et A. Dolla) ; et la détermination de nouvelles thiorédoxines impliquées dans le stress oxydant des organismes anaérobies (collaboration avec L. Pieulle).

II Interactions protéine/ligand et assemblage des macromolécules

L’étude des interactions entre protéines est la caractéristique de notre équipe. Les approches développées en cartographie de zones d’interaction associées à l’arrimage moléculaire en a fait son renom au niveau national et international (articles 1, 2, 4, 5, 20). Axée sur la complémentarité RMN/cristallographie, l’objet de nos travaux est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base des assemblages macromoléculaires impliquant les protéines et leurs partenaires cellulaires protéines, sucre, ADN, ARN ou lipides. Trois projets peuvent illustrer les résultats obtenus ces quatre dernières années.

1- L’hydrogénase NADP réductase

(collaboration avec Zorah Dermoun, IMR) L’hydrogénase NADP réductase de Desulfovibrio fructosovorans est un enzyme tetramérique très instable. Un projet de détermination de structure par RMN est rendu possible par une approche modulaire couplée au « docking contraint expérimentalement ». Chaque sous unité de l’enzyme est modélisée, puis sur la base de données RMN, des modèles d’organisation de ces sous unités en complexes permettent de proposer l’arrangement moléculaire de l’enzyme. A ce niveau l’apport du SAXS est déterminant puisqu’il permet de choisir un modèle sur des bases expérimentales. Ce travail a fait l’objet de la thèse de M. Nouailler et de l’article 20.

2- Les complexes protéine/Acide nucléique

L’étude des interactions protéine /acides nucléiques est également abordée dans le cadre de la plateforme de RMN, puisque les acides nucléiques sont le domaine de recherche d’Olivier Bornet. Deux thèmes ont été traités principalement : le complexe TRF2/ADN en collaboration avec M. J. Giraud-Panis de l’ENS de Lyon (article 45). Un second projet est développé avec A. Tzakos (Université de Ionina, Grèce) sur des domaines RRM.

3- Le complexe Galectine/sucre

(collaboration avec Claudine Shiff, IPC, et Philippe Roche, IMR) Ce projet a deux objectifs : d’une part, l’étude structurale du complexe Galectine-1/PreB qui est impliqué dans la maturation des anticorps ( sujet de M2 M. Feracci) et d’autre part, comprendre la spécificité des différentes galectines humaines pour leurs partenaires glycosylés (sujet de thèse de C.Meynier). Ce projet a été initié avec un financement ANR en 2005, puis a été soutenu par le CNRS avec le recrutement de Latifa ElAntak en 2008. Il fait l’objet de la publication de trois articles (deux soumis, le troisième en cours de rédaction). L. ElAntak a également obtenu sur ce thème une bourse d’aide au retour de la FRM dans le laboratoire de C. Schiff au CIML à Marseille en 2008.

III Conception d’inhibiteurs et dysfonctionnement cellulaire

Cette activité découle directement de la précédente puisque nous ciblons l’inhibition des interactions macromoléculaires. Les activités de drug design développées ces quatre dernières années par Xavier Morelli (2P2I) seront décrites dans le rapport d’activité de son groupe. Nous allons plus particulièrement considérer nos activités centrées sur la conception de peptides mimétiques.

1- Inhibiteurs de la protéine Nef du HIV

(Projet ANRS coordonné par Yves Collette, IPC). Ce projet a été initié par D. Baty qui a réalisé une banque de peptides ciblant NEF du HIV par phage display. Une séquence consensus de peptides inhibiteurs a été identifiée par synthèse chimique des peptides et nous avons développé une étude structurale par RMN associée à une étude cellulaire réalisée par Y. Colette. Ce travail réalisé en collaboration avec X. Morelli a été soutenu par un financement ANRS et a donné lieu à un brevet.

2- Inhibiteurs du complexe ErbB2/MEMO

(Projet INCA en collaboration avec Yves Collette et Ali Badache, IPC) La protéine ERBB2 est surexprimée dans le cadre de certains cancers du sein. La protéine MEMO est impliquée dans la prolifération cellulaire et notamment dans la migration cellulaire entrainant la formation de métastases. Nous étudions la structure du complexe MEMO/peptide C-terminal phosphorylée d’ERBB2 afin de réaliser une conception d’inhibiteurs de cette interaction par peptide mimétique. Ce travail a été financé par l’INCa via le cancéropole PACA pour lequel nous sommes labélisés. M. Feracci a obtenu une bourse fléchée biologie/informatique de l’INCa sur ce thème là.

IV Fonction des macromolécules : protéines impliquées dans la réponse au stress oxydant chez les organismes anaérobies

L’aspect spectroscopie de la RMN permet de cribler de nombreux substrats et d’envisager la fonction de macromolécules. Cet aspect intéresse un grand nombre de microbiologistes de l’Institut et la plateforme de RMN essaie de répondre au mieux à cette attente. Le projet développé ces dernières années sur les COGs des bactéries anaérobies, en collaboration avec le groupe d’Alain Dolla est certainement le meilleur exemple de l’approche utilisée. La structure cristallographique de la protéine TM0486 de Thermotoga maritima a été soumise à la PDB sans publication car de fonction inconnue. Les auteurs décrivent la présence d’une molécule non identifiée pouvant être son substrat. Sur la base de données biologiques obtenues par Zorah Dermoun, nous avons testé par RMN l’effet du TPP et de la Thiamine. Les deux molécules se fixent sur la protéine et entrainent une oligomérisation de la protéine TM0486. Ces données sont en accord avec l’état tétramérique de la protéine dans la structure cristallographique. Une modélisation par P. Roche du substrat potentiel (TPP) dans les clichés de diffraction des cristallographes est en accord avec la présence du TPP dans le tétramère. Ce travail va donner lieu à la rédaction d’un article commun avec les cristallographes.

V Perspectives

Durant ces quatre dernières années, notre groupe a réalisé un développement méthodologique très important dans les domaines de la RMN hétéronucléaire. Nos travaux s’inscrivent à l’interface des projets développés par les deux autres groupes de l’Unité. La collaboration bien établie avec le groupe d’Alain Dolla dans les domaines de la RMN structurale et de la RMN métabolique devrait permettre le développement d’un nouveau projet de métabonomique où la RMN a une place de choix. Les outils développés par Philippe Roche de modélisation moléculaire de la dynamique des protéines sont en parfaite adéquation avec les projets développés par notre équipe. Une collaboration avec Carine Van Heijnenoort à Gif, sur la dynamique des protéines par RMN devrait permettre un lien très intéressant entre nos données structurales et les paramètres de dynamique au sein de complexes. L’apport des techniques de SAXS, développées par Véronique Receveur-Bréchot, sera également capital au développement des études des assemblages moléculaires. Enfin l’approche de validation de molécules inhibitrices mise en place en collaboration avec X. Morelli a donné lieu à la naissance d’une nouvelle plateforme de criblage in silico, la publication d’un article dans PNAS et l’obtention de deux brevets. Les activités des deux plateformes RMN et criblage in silico sont fortement associées et appréciées par nos collègues du Cancéropôle et par un grand nombre d’industriels. Ces développements se poursuivent dans le cadre d’une forte collaboration sur de nouveaux projets d’intérêt biomédical.


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